CHO 細胞表達的水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus, VZV)糖蛋白 E (VZV gE) 降低了因糖基化差異發(fā)生人體免疫反應的風險;同時， CHO 細胞能夠整合外源基因，利于外源蛋白的穩(wěn)定表達。哺乳動物細胞培養(yǎng)與傳統(tǒng)的微生物細胞相比難度較大，主要是由于哺乳動物細胞倍增時間長、代謝途徑復雜、對營養(yǎng)要求苛刻，目前常用的哺乳動物細 胞培養(yǎng)方式主要分為流加培養(yǎng)、批次培養(yǎng)、以及灌流培養(yǎng)。大多數(shù)生物醫(yī)藥分子是不穩(wěn)定的，在流加培養(yǎng)和批次培養(yǎng)過程中，細胞產生的代謝產物和釋放的酶，以及滲透壓的增加都不利于細胞生長和蛋白表達。灌流培養(yǎng)可以不斷地輸出代謝副產物，輸入新鮮培養(yǎng)基，為細胞生長提供一個穩(wěn)定環(huán)境，降低產物在培養(yǎng)基中的停留時間，有利于提高產品質量。YANG 等研究表明，灌流培養(yǎng)有望在產能上實現(xiàn)小型生產設備取代大型生產設備的目標。因此，對灌流培養(yǎng)工藝的開發(fā)與優(yōu)化成為哺乳動物細胞培養(yǎng)工藝研究的熱點，F(xiàn)DA 也鼓勵生物制藥生產工藝由傳統(tǒng)批次培養(yǎng)轉型到灌流培養(yǎng)。灌流培養(yǎng)主要受以下幾個關鍵因素影響：培養(yǎng)溫度、pH、灌流速度等。調節(jié)好培養(yǎng)過程中的關鍵因素，可以大大提高灌流培養(yǎng)的細胞密度和蛋白表達量。

實驗方法與材料詳見

莊宗蘭，程杰，彭杰，周云，祁碧玉，楊文靜，楊世龍，譚小東.超聲截留 

灌流培養(yǎng)重組 CHO 細胞工藝優(yōu)化[J/OL].微生物學免疫學進展 https://kns.cnki.net/kcms/detail/62.1120.R.20220513.1813.008.html

值得借鑒的方法

響應面分析

Box-Behnken 實驗設計，利用 Design experts 8.0 軟件擬合數(shù)據(jù)，然后對回歸方程取一階偏導求解得到最佳培養(yǎng)條件為：灌流培養(yǎng)溫度 33.2 °C，pH 7.0，灌流速度 4.1 mL/min。

過程參數(shù)監(jiān)控數(shù)據(jù)變化

3 批驗證結果顯示，相較批培養(yǎng)，灌流培養(yǎng)時間延長 5~7 d，收獲體積增加 5~7 倍。從培養(yǎng) 1 d 開始，對 3 組實驗細胞每天取樣，檢測培養(yǎng)液中葡萄糖和乳酸含量變 化，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)體系中的葡萄糖含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，從初始的約 6 g/L 降低至 2 g/L。由于細胞代謝的作用培養(yǎng)液中乳酸含量不斷累加，從 0.1 g/L 升高至 1.9 g/L，葡萄糖和乳酸含量變化趨勢，見圖 2。

細胞密度從培養(yǎng) 3 d 開始進入指數(shù)生長期，7 d 進入平臺期，最高細胞 密度達到 1.6×107/mL。隨著培養(yǎng)時間的延長和代謝物質的累加，細胞活性逐漸下降，培養(yǎng)至 13 d 時細胞活 性低于 80%，停止培養(yǎng)，見圖 3。 

結論

本研究對 CHO 細胞的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，利用已優(yōu)化的培養(yǎng)條件進行 3 批灌流培養(yǎng)重組 CHO 細胞表 達 VZV gE 蛋白。灌流培養(yǎng)與批次培養(yǎng)相對分子質量一致，且發(fā)生糖基化修飾。

   在灌流培養(yǎng)后期，降低培養(yǎng) 溫度，重組 CHO 細胞活率相較于 37 °C條件下提高了約 20%，gE 蛋白表達量提高了約 2 倍。與批培養(yǎng)相比， 灌流培養(yǎng)的時間延長了 5~7 d，收獲體積增加了 5~7 倍。影響哺乳動物細胞生長的因素很多，包括葡萄糖含量、乳酸含量、溫度、灌流速度、pH 等。

     葡萄糖作為細胞代謝過程中最重要的營養(yǎng)物質和細胞生長所需碳源，不論是在批次培養(yǎng)還是流加培養(yǎng)過程中，都是重要的考量因素。

在批次培養(yǎng)和流加培養(yǎng)過程中過高的葡萄糖濃度會導致高乳酸濃度的積累，從而不利于細胞的生長及表達。在灌流培養(yǎng)過程中，為了更高效地利用培養(yǎng)基，可以通過降低灌流速率的同時提高培養(yǎng)基中起始葡萄糖濃度，既保證細胞代謝過程中能量及碳源的充足，又提高培養(yǎng)基的利用率及降低生產成本。因為灌流培養(yǎng)過程中代謝副產物(如乳酸)不斷被帶出，濃度不斷被稀釋，一定高濃度的葡萄糖可能并不導致其代謝副產物有較高的累積，故培養(yǎng)液中葡萄糖濃度可被列為灌流培養(yǎng)工藝開發(fā)過程中一個重要的考量因素。